Accelerazione nanoplasmonica dell'amplificazione dell'acido nucleico per il rilevamento dei patogeni

Nature Nanotechnology volume 18, pagine 846–847 (2023)Citare questo articolo

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È stato dimostrato che un sistema automatizzato che accoppia la microfluidica con l'iniezione plasmonica di elettroni caldi per accelerare il rilevamento colorimetrico dell'amplificazione di DNA e RNA raggiunge una precisione di rilevamento del 95% nei campioni di saliva umana. Questa tecnica utilizza diversi test di amplificazione per l'identificazione dei patogeni e può distinguere tra varianti e sottotipi virali.

I lunghi protocolli coinvolti nei test basati sul rilevamento e sulla replicazione dell'acido nucleico tramite sonde di acido nucleico (test di amplificazione) rendono difficile il rilevamento rapido degli agenti patogeni nel momento del bisogno, per non parlare dell'automazione del processo dalla preparazione del campione al risultato1. Questa restrizione ostacola il processo decisionale relativo alla gestione della diffusione delle infezioni respiratorie virali che, a causa della loro crescente incidenza, colpiscono sempre più la popolazione e l’economia globale. Tali limitazioni sono state particolarmente evidenziate nelle prime fasi della pandemia di COVID-19, quando si è compiuto uno sforzo a livello mondiale per sviluppare e utilizzare test diagnostici. Attualmente, i test antigenici sono i test di scelta per le situazioni di necessità grazie al loro funzionamento semplice e veloce. Tuttavia, i test antigenici hanno una sensibilità inferiore rispetto ai test della reazione a catena della polimerasi (PCR)2, il che ne ostacola l’applicabilità per informare il processo decisionale sanitario all’inizio dell’infezione.

Proponiamo una tecnica - QolorEX - per ottenere una lettura colorimetrica quantitativa senza etichetta con risoluzione a singolo nucleotide, che può ottenere un risultato in pochi minuti. Questo approccio integra l'amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa basata sul rosso fenolo (RT-LAMP) e i test colorimetrici di amplificazione del cerchio rotante (RCA)3 con microfluidica nanosuperficiale plasmonica miniaturizzata per ottenere la catalisi plasmonica hot-spot4. Per semplificare la reazione di amplificazione, abbiamo sviluppato una cartuccia microfluidica che utilizza l'attuazione microfluidica dipendente dall'angolo regolabile per integrare l'intero ciclo di raccolta del campione, lisi, aggiunta di reagenti di analisi, amplificazione dell'acido nucleico e rilevamento (Fig. 1a). Per ridurre gli errori introdotti dall'utente, abbiamo sviluppato una scatola di imaging accoppiata all'illuminazione con attuatori automatizzati per gestire, riscaldare e visualizzare la cartuccia microfluidica senza richiedere input da parte dell'utente. Questa automazione consente all'utente di toccare un pulsante su un'applicazione del telefono cellulare per avviare il funzionamento sequenziale della cartuccia microfluidica. La lettura colorimetrica viene rilevata automaticamente dalla fotocamera CMOS (metallo-ossido-semiconduttore complementare) integrata nell'imaging box. Un algoritmo di apprendimento automatico analizza quindi la lettura e stabilisce risultati positivi o negativi; il risultato viene poi inviato al cellulare dell'utente.

a, Uno schema del funzionamento di QolorEX. L'utente sputa la saliva nell'imbuto di raccolta e inserisce la cartuccia microfluidica all'interno della scatola di imaging. I risultati vengono quindi trasmessi automaticamente tramite un’app per smartphone. b, Dopo l'eccitazione della luce, il nanomateriale plasmonico accelera il test di amplificazione a causa degli elettroni in eccesso sull'interfaccia di reazione. L'aumento della velocità di amplificazione aumenta la velocità di produzione di protoni, che diminuiscono il pH del mezzo, facendo sì che il rosso fenolo cambi rapidamente colore da fucsia a giallo in presenza dell'agente patogeno target (mostrato nel riquadro). dNTP, desossiribonucleotide trifosfato; DOS, densità degli stati; E, energia; EF, energia di Fermi; ϕanalisi, energia di inizio della reazione di ossidazione; ħω, energia fotonica; ΔV, volume della camera di rilevamento. © 2023, AbdElFatah, T. et al.

Abbiamo dimostrato che la rapida lettura colorimetrica ottenuta con QolorEX dipende fortemente dall'iniezione di elettroni "caldi" eccitati dalla luce dalla superficie di nanoparticelle plasmoniche autoassemblate nella miscela di campione e reagenti del test nella camera di rilevamento. Questi elettroni caldi accelerano la reazione nucleofila nella fase di polimerizzazione dell'amplificazione, che a sua volta si traduce nella trasformazione cromatica senza etichetta dipendente dal pH del rosso fenolo dal fucsia al giallo (Fig. 1b). Abbiamo scoperto che le superfici plasmoniche con nanoparticelle di 400 nm di diametro offrivano un maggiore potenziamento del campo elettromagnetico e associati effetti di catalisi plasmonica hot-spot rispetto alle superfici plasmoniche con nanoparticelle di altre dimensioni, con conseguente accelerazione media di 9 volte nella velocità di reazione di amplificazione.